眾所周知，人類(lèi)設(shè)計(jì)除草劑是為了殺死雜草，而在除草劑被反復(fù)使用的過(guò)程中自發(fā)的雜草除草劑抗性突變有巨大的選擇優(yōu)勢(shì)，并往往會(huì)迅速主導(dǎo)雜草種群。導(dǎo)致雜草快速適應(yīng)并表現(xiàn)抗性的兩種主要機(jī)制是非靶點(diǎn)抗性(NTSR)和靶點(diǎn)抗性(TSR)。NTSR是指降解或物理上阻止活性成分達(dá)到其目標(biāo)的過(guò)程，NTSR通常涉及多個(gè)基因，抗性通常是定量的。TSR具有更多的定性效應(yīng)，例如對(duì)高水平除草劑的抗性為特征，并且可以追溯到改變除草劑靶標(biāo)酶中單個(gè)氨基酸的大效應(yīng)基因突變。雖然這對(duì)農(nóng)民來(lái)說(shuō)是個(gè)麻煩，但也為詳細(xì)研究生物體如何快速響應(yīng)強(qiáng)烈的選擇提供了機(jī)會(huì)，尤其是新產(chǎn)生的突變和群體中已存在的突變都起到什么樣的作用，哪個(gè)更重要？

近日，德國(guó)霍恩海姆大學(xué)、馬普生物所、根特大學(xué)、美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)、奧地利科學(xué)院、弗雷德里希·米歇爾實(shí)驗(yàn)室以及巴斯夫公司的聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)在《PNAS》在線(xiàn)發(fā)表了題為“Standing genetic variation fuels rapid evolution of herbicide resistance in blackgrass”的研究論文，介紹了研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)組裝大穗看麥娘( Alopecurus myosuroides )高質(zhì)量參考基因組、分析已知抗除草劑等位基因變異以前向時(shí)間算法模擬發(fā)現(xiàn)TSR可能主要是由群體中已存在遺傳變異引起的，而新的突變只起次要作用，此外TSR的出現(xiàn)很可能早于除草劑的應(yīng)用。這對(duì)于雜草防治和除草劑的可持續(xù)利用具有積極的指導(dǎo)意義。

為了進(jìn)行基因組測(cè)序和組裝，研究團(tuán)隊(duì)從一個(gè)來(lái)源于德國(guó)的除草劑敏感群體（Appels Wilde Samen GmbH, Darmstadt）中選擇了一個(gè)未攜帶已知ACCase、ALS或葉綠體psbA位點(diǎn)TSR突變的單株作為參考。前人通過(guò)福爾根光度法估計(jì)大穗看麥娘（A. myosuroides）基因組大小范圍為4.2 Gb到4.7 Gb。為了更準(zhǔn)確地估計(jì)所選單株的基因組大小，研究團(tuán)隊(duì)用黑麥（Secale cereale）作為參考標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行了流式細(xì)胞測(cè)量，估量單倍體基因組大小為3.56 Gb（圖1A）。通過(guò)獲得約90倍的基因組覆蓋率的PacBio連續(xù)長(zhǎng)片段（CLRs）、約44倍基因組覆蓋率的Illumina PCR-free短讀長(zhǎng)以及約66倍基因組覆蓋率的Hi-C染色質(zhì)接觸數(shù)據(jù)，研究團(tuán)隊(duì)用FALCON-Unzip的方法從頭組裝了大穗看麥娘的基因組，最終組裝大小為3.53 Gb，由七個(gè)Super-scaffolds組成（圖1B）。

組裝的大穗看麥娘的基因組與其他雜草類(lèi)相比，其染色體水平的線(xiàn)性關(guān)系很高，其中線(xiàn)性關(guān)系最高的是青稞（Hordeum vulgare）（圖1C）。大穗看麥娘基因組的第2、3、4、5和7號(hào)染色體分別與青稞基因組第3、2、6、1和5號(hào)染色體有接近1：1的同義替換關(guān)系（圖1D）。一個(gè)例外是大穗看麥娘基因組的1號(hào)染色體（807 Mb）包含了與青稞基因組第4、5和7號(hào)染色體呈線(xiàn)性關(guān)系的片段。

新組裝的大穗看麥娘參考基因組使得評(píng)估歐洲范圍內(nèi)大穗看麥娘基因組的遺傳多樣性變得容易。研究團(tuán)隊(duì)對(duì)1123個(gè)大穗看麥娘單株進(jìn)行了ddRAD-Seq測(cè)序，這些單株全部來(lái)源于田間疑似抗除草劑的個(gè)體，代表了來(lái)源于9個(gè)歐洲國(guó)家的44個(gè)種群，每個(gè)種群有22-24個(gè)單株。為了進(jìn)行比較，研究團(tuán)隊(duì)還加入了三個(gè)除草劑敏感的參考種群（圖2）。該實(shí)驗(yàn)平均測(cè)序深度為22.6倍，研究團(tuán)隊(duì)共鑒定到109924個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）。最大似然法（ML）進(jìn)化樹(shù)分析顯示，并未發(fā)現(xiàn)每個(gè)國(guó)家明確的系統(tǒng)進(jìn)化情況（圖2A）。

種群之間的總體遺傳變異很低（F_ST范圍：0.01至0.05，n = 47；圖 2C），這與其他大穗看麥娘及其他野生雜草的研究類(lèi)似。種群內(nèi)個(gè)體的相關(guān)度很高（FIS=0.1；范圍0.06至0.12）。在混合分析中，研究團(tuán)隊(duì)鑒別出7到9個(gè)祖先群（圖2D），這與主成分分析（PCA）的聚類(lèi)結(jié)果一致（圖2B、D）。來(lái)自比利時(shí)（BE）、英國(guó)（UK）、盧森堡（LX）和法國(guó)（FR）的單株在遺傳上非常相似并聚集在一起。來(lái)自荷蘭（NL）的一個(gè)種群NL11330其他種群差異最大，F_ST值高達(dá)0.05（圖2C）。來(lái)源德國(guó)（DE）的單株被分為三個(gè)亞群，其中一個(gè)亞群與瑞士（CH）的個(gè)體有共同的祖先，另一個(gè)與奧地利（AT）的個(gè)體有共同的祖先，第三個(gè)亞群是高度混雜的。波蘭（PL）的種群與荷蘭的NL0166種群有共同的祖先。綜上，整個(gè)歐洲范圍內(nèi)存在清晰的大穗看麥娘地理群體結(jié)構(gòu)，盡管目前的數(shù)據(jù)無(wú)法推斷大穗看麥娘地理遷移的軌跡。

大部分關(guān)于除草劑耐藥性分子機(jī)制的研究都集中于除草劑抑制酶基因的突變上，主要是ALS和ACCase編碼基因，二者均可被一系列結(jié)構(gòu)不同的化學(xué)物質(zhì)抑制。為了了解特定位點(diǎn)突變和整體單倍型的多樣性，研究團(tuán)隊(duì)擴(kuò)增和分析了所有歐洲群體個(gè)體約13.2 kb的ACCase基因和約3.6 kb的ALS基因的片段。結(jié)果顯示，最常見(jiàn)ACCase基因突變是Ile1781Leu，這與該替換突變的多效性相一致，該替換突變也會(huì)在沒(méi)有選擇壓力的情況下產(chǎn)生而增加個(gè)體的適應(yīng)性（圖3 A-C）。TSR突變通常以顯性方式作用，71.4%的ACCase基因TSR突變以雜合子的形式出現(xiàn)。

ACCase基因單倍型的PCA分析可將所有個(gè)體分為三個(gè)主要群體。為了更好地描述ACCase單倍型的多樣性，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了單倍型進(jìn)化樹(shù)和關(guān)系網(wǎng)分析（圖3），結(jié)果顯示，不同復(fù)雜性的單倍型網(wǎng)絡(luò) (圖3 A-C）可能反映了每個(gè)種群所受到的選擇壓力。在群體中，有TSR突變的27個(gè)種群中只有4個(gè)種群含有單一的TSR單倍型，且單一TSR單倍型的基因頻率很低，只有不到10%，從定義上來(lái)講上，這反映了很可能存在早期的“硬掃蕩”，但是其他23個(gè)種群中至少有兩個(gè)TSR突變的單倍型，這說(shuō)明“軟掃蕩”是正常的。在其中14個(gè)種群中，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了來(lái)源于不同獨(dú)立突變事件的不同TSR突變單倍型，而不是同一TSR突變被通過(guò)重組轉(zhuǎn)移到其他單倍型上（圖3D）。這一觀(guān)察結(jié)果以一種無(wú)偏見(jiàn)的方式證實(shí)了早期探索性研究的推論。同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了從同一單倍型的單個(gè)區(qū)域產(chǎn)生了兩個(gè)或三個(gè)不同的TSR突變的7個(gè)單株（圖3 B、C和E）。獨(dú)立的(非重合）ACCase TSR單倍型的最大值是10。

使用除草劑的強(qiáng)大選擇壓力導(dǎo)致了雜草非?？焖俚目剐赃m應(yīng)，但這有一個(gè)主要的問(wèn)題：除草劑抗性主要由在使用除草劑之前群體中就已存在的遺傳變異演變而來(lái)還是使用除草劑后出現(xiàn)的新的突變演變而來(lái)？為了回答這個(gè)問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)使用Hermisson & Pennings的方程，推導(dǎo)出適應(yīng)性的概率（即通過(guò)TSR突變進(jìn)化出的除草劑抗性）的期望值，以及這種適應(yīng)性是由于群體中已存在遺傳變異演化而來(lái)的可能性。結(jié)果顯示，除草劑選擇發(fā)生之前的TSR變異的有害選擇系數(shù)對(duì)適應(yīng)的概率只有很小的影響（圖4）；TSR突變可能主要是由群體中已存在遺傳變異引起的，而新的突變只起次要作用（圖5）。

圖4 不同場(chǎng)景適應(yīng)性的模擬

綜上所述，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)不同情況下大穗看麥娘除草劑適應(yīng)性的研究表明，隨著人類(lèi)對(duì)多樣性的除草劑抗性機(jī)制的了解，很大一部分大穗看麥娘種群可能早已具備了針對(duì)目前使用除草劑的抗性和未來(lái)潛在新作用方式的適應(yīng)性的的遺傳變異，這對(duì)我們發(fā)展可持續(xù)的除草劑使用策略具有重要的指導(dǎo)意義。

Kersten S, Chang J, Huber C D, et al. Standing genetic variation fuels rapid evolution of herbicide resistance in blackgrass[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2023, 120(16): e2206808120.

北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心是由北大荒墾豐種業(yè)股份有限公司和上海澤泉科技股份有限公司共同建設(shè)的開(kāi)放式高通量植物基因型-表型-育種服務(wù)平臺(tái)。中心建立了基因克隆和載體平臺(tái)、作物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、基因型分析平臺(tái)、表型鑒定分析平臺(tái)、數(shù)據(jù)分析和利用平臺(tái)等現(xiàn)代化生物技術(shù)和信息支持平臺(tái)，是定位于為植物科研和作物育種提供植物基因型-表型-育種數(shù)據(jù)分析的科研服務(wù)平臺(tái)。

為了縮短您的育種進(jìn)程，提高您的育種成功率，北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心將為您提供：分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與檢測(cè)服務(wù)+分子標(biāo)記輔助選擇/回交育種服務(wù)+高通量抗性表型鑒定的硬件和服務(wù)方案。

根據(jù)目標(biāo)DNA/基因序列,可開(kāi)發(fā)高效的分子標(biāo)記（SNP-KASP、SSR等），并可實(shí)現(xiàn)單日最高一萬(wàn)SSR數(shù)據(jù)點(diǎn)，以及數(shù)以十萬(wàn)計(jì)的SNP數(shù)據(jù)點(diǎn)檢測(cè)。

SSR-瓊脂糖電泳圖

SNP-基因分型圖

分子標(biāo)記輔助選擇/回交育種服務(wù)

利用分子標(biāo)記輔助目標(biāo)基因選擇、背景選擇和去連鎖選擇，針對(duì)優(yōu)良自交系的個(gè)別“短板”進(jìn)行“定向”改良，回交不超過(guò)3代，獲得與原自交系一致或高度相似的新材料。

應(yīng)用領(lǐng)域：水稻、玉米、大豆、小麥等作物定向改良。

植物結(jié)構(gòu)特征性很強(qiáng)，具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。對(duì)自然界的植物形態(tài)及生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行建模，有利于探索植物生長(zhǎng)過(guò)程的規(guī)律，同時(shí)還能在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中指導(dǎo)作物栽培、新品種選育及模擬農(nóng)作物管理。北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心培養(yǎng)室內(nèi)植物，對(duì)其進(jìn)行 3D 掃描成像，可構(gòu)建三維點(diǎn)陣云圖，還可以通過(guò)可見(jiàn)光結(jié)合計(jì)算機(jī)視覺(jué)，可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化非破壞性的高通量分析。作物穗結(jié)構(gòu)與種子性狀屬于多基因位點(diǎn)控制的數(shù)量性狀，可間接反映產(chǎn)量潛力、種子的活力和質(zhì)量，研究穗結(jié)構(gòu)與種子性狀，對(duì)于育種、種質(zhì)資源研究具有深遠(yuǎn)意義。常規(guī)的穗結(jié)構(gòu)與種子性狀分析多采用人眼觀(guān)察、尺子測(cè)量的方法，誤差大，可實(shí)現(xiàn)的參數(shù)少，可重復(fù)性差。北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心標(biāo)準(zhǔn)化無(wú)損的高通量測(cè)量穗結(jié)構(gòu)以及種子，大大提高了測(cè)量精度以及效率。

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