凍存茄科花粉質(zhì)量檢測(cè)方法的評(píng)估
日期:2023-08-14 17:52:48

有活力的花粉是植物成功繁育的基本要素之一,也是形成種子的先決條件。能夠長(zhǎng)期保存有活力的花粉可為農(nóng)業(yè)、林業(yè)和園藝領(lǐng)域創(chuàng)造育種和生產(chǎn)的靈活性,并實(shí)現(xiàn)跨越地理和季節(jié)限制的有效雜交,從而減少在授粉過(guò)程中雌雄植株同步開(kāi)花的協(xié)調(diào)工作并確保授粉花粉的可用性。茄科植物花粉冷凍保存是全世界雜交種子生產(chǎn)行業(yè)的普遍做法,集中進(jìn)行花粉生產(chǎn)對(duì)于確保知識(shí)產(chǎn)權(quán)、降低多年種子生產(chǎn)計(jì)劃中的雌雄比例以及花粉生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)管理等戰(zhàn)略來(lái)說(shuō)具有特別重要的意義。


花粉冷凍保存通常包括脫水、冷卻、儲(chǔ)存、解凍和再水合這一系列過(guò)程,每個(gè)過(guò)程的出錯(cuò)會(huì)嚴(yán)重影響最終的花粉質(zhì)量,尤其是在工藝條件不理想的情況下,因此,監(jiān)測(cè)花粉供應(yīng)鏈上各個(gè)環(huán)節(jié)的花粉質(zhì)量是十分必要的。目前,育種者和種子生產(chǎn)商已將花粉活力檢測(cè)作為一種風(fēng)險(xiǎn)管理工具,以防止低質(zhì)量授粉而導(dǎo)致的產(chǎn)量損失。


傳統(tǒng)上進(jìn)行花粉活力的評(píng)估多以顯微鏡為基礎(chǔ),如通過(guò)顯微鏡觀察花粉大小的變化、熒光或非熒光染料染色后花粉新陳代謝活動(dòng)或膜的完整性、萌發(fā)率以及花粉管的生長(zhǎng)情況,此類檢測(cè)中的數(shù)據(jù)分析通常通過(guò)人為量化細(xì)胞亞群或使用圖像處理軟件工具來(lái)完成。近些年,該領(lǐng)域逐漸引入了庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器和阻抗流式細(xì)胞儀(IFC),如瑞士Amphasys公司的Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀就是專為分析花粉質(zhì)量而研發(fā)的設(shè)備,其原理是通過(guò)檢測(cè)流經(jīng)微流控芯片的單個(gè)花粉粒的電阻抗特性來(lái)區(qū)分花粉活力。對(duì)比勞動(dòng)強(qiáng)度、分析和動(dòng)手耗時(shí)、結(jié)果可靠性、標(biāo)準(zhǔn)化程度和測(cè)試成本等方面,所有這些技術(shù)都各有優(yōu)缺點(diǎn)。


本研究通過(guò)IFC活力法、體外萌發(fā)法以及花粉管長(zhǎng)度分析,檢測(cè)了同一批冷凍保存下的番茄和辣椒花粉樣本,并對(duì)三種花粉質(zhì)量分析方法進(jìn)行了評(píng)估,以確定其是否適用于冷凍保存下的花粉的常規(guī)質(zhì)量控制。結(jié)果表明

  i. Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀(IFC活力法)得到的花粉活性可以解釋為花粉的發(fā)芽潛力,而體外萌發(fā)法則可在給定的發(fā)芽條件下直接量化花粉的發(fā)芽潛能,兩種分析方法之間存在線性相關(guān);

  ii. 對(duì)自動(dòng)化程度、通量、可重復(fù)性和再現(xiàn)性要求高的應(yīng)用和行業(yè)來(lái)說(shuō),IFC活力法的理想的檢測(cè)工具;

  iii. 由于難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化,體外萌發(fā)法只適用于有一定時(shí)間和地域限制的研究;

  iv. 由于通量低且可重復(fù)性差,通過(guò)花粉管長(zhǎng)度分析花粉活性不能充分滿足行業(yè)需求。


IFC數(shù)據(jù)與顯微鏡鏡檢數(shù)據(jù)的相關(guān)性



花粉萌發(fā)過(guò)程中,通過(guò)觀察顯微鏡下花粉的形態(tài)特征進(jìn)行花粉形態(tài)亞型的分類,見(jiàn)表1。利用Ampha Z32(IFC)檢測(cè)花粉的電阻抗特性,并通過(guò)分析二維相位-振幅散點(diǎn)圖量化活花粉、死花粉以及異?;ǚ?,見(jiàn)圖1b。IFC活力法與顯微鏡鏡檢數(shù)據(jù)的比較表明:
  i. 冷凍保存的不同批次的花粉可能具有非常不同的細(xì)胞亞群組成(圖1c);
  ii. 冷凍保存下不同批次的花粉質(zhì)量可能有很大差異(圖1c),使用低質(zhì)量批次的花粉有授粉不足的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)也為使用稀釋劑(如石松孢子)稀釋高質(zhì)量批次的花粉提供了機(jī)會(huì);
  iii. IFC活力法鑒定出的活花粉對(duì)應(yīng)于萌發(fā)過(guò)程中形態(tài)可重組的那部分花粉(圖1d);
  iv. IFC活力法與萌發(fā)鏡檢法對(duì)異常細(xì)胞的量化結(jié)果相似(圖1c);
  v. 在給定萌發(fā)條件下,有活力但未能萌發(fā)的這部分花粉在成熟度上具有高度的樣品特異性,其占比為8.7%-43.3%,這些花粉能夠在形態(tài)上重建,但不能在功能上重組(圖1c)。



表1 花粉粒的不同形態(tài)亞型

分類

描述

圖示

Aberrant

異?;ǚ?/span>

異常細(xì)胞與小孢子發(fā)育的中止有關(guān),例如由于熱脅迫導(dǎo)致的敗育

表1-1.png

Aberrant

脫水花粉

這些花粉再水合并懸浮于萌發(fā)緩沖液中后,不能在形態(tài)上重建??梢郧宄乜吹筋愃?"咖啡豆 "的溝紋。

表1-2.png

Reconstituted, 

not germinated


這類花粉粒通過(guò)再水合并懸浮在發(fā)芽緩沖液中,在形態(tài)上得以重組,但沒(méi)有形成花粉管,如圖1a–II

表1-3.png

Reconstituted, 

pollen tube emerging

這些花粉粒形成了花粉管,但花粉管的長(zhǎng)度短于花粉的直徑

表1-4.png

Reconstituted, 

pollen tube longer than pollen diameter

這些花粉粒形成了花粉管,但花粉管的長(zhǎng)度短于花粉的直徑

表1-5.png


圖123080901.jpg

圖1 a. 顯微鏡下冷凍番茄花粉再水合過(guò)程中的形態(tài)重建(比例尺=50μm):a-I)冷凍保存的番茄花粉,呈溝狀形態(tài);a-II)在95-99%相對(duì)濕度下再水合30min后的番茄花粉,重建為更球形的形態(tài);b. IFC火力法可量化不同類型的茄科花粉:圖上每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一粒花粉,通過(guò)分析可在相位-振幅散點(diǎn)圖中設(shè)置門控區(qū)分活化粉粒、死花粉粒和異常花粉粒;c .番茄花粉類群的量化:百分比柱狀堆積圖:顯微鏡鏡檢法;散點(diǎn)圖:IFC活力法d. 辣椒和番茄花粉的樣品活性(IFC活力法)與形態(tài)可重建花粉占比(顯微鏡鏡檢)的相關(guān)性分析。


IFC活力法vs.體外萌發(fā)法vs.花粉管長(zhǎng)度分析



圖223080901.jpg


圖2 IFC活力法、體外萌發(fā)法、花粉管長(zhǎng)度分析三種花粉質(zhì)量評(píng)估的比較


荷蘭和瑞士?jī)蓚€(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的20個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果表明,IFC活力法與體外萌發(fā)法之間有很強(qiáng)的正相關(guān)性(圖2a,番茄R2=0.77,辣椒R2=0.87)。其中,番茄和辣椒的體外萌發(fā)率分別比IFC活力平均低26%和19%。IFC活力和花粉管長(zhǎng)度之間也存在正相關(guān)性,表明質(zhì)量較高的花粉批次往往含有更多活力更強(qiáng)的花粉,從而形成更長(zhǎng)的花粉管(圖2b)。體外發(fā)芽率與花粉管長(zhǎng)度間也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果(圖2c)。


不同測(cè)量方法的再現(xiàn)性和重復(fù)性


IFC法的再現(xiàn)性非常高,花粉活性平均偏差為5%(圖3a),可重復(fù)性強(qiáng);體外萌發(fā)法再現(xiàn)率略低,平均偏差為9%,可重復(fù)性中等;花粉管進(jìn)行活力評(píng)估的結(jié)果差異較大,重復(fù)性較差。


圖323080901.jpg

圖3 不同試驗(yàn)方法的再現(xiàn)性和重復(fù)性


圖423080901.jpg

圖4 發(fā)芽培養(yǎng)基滲透壓對(duì)離體番茄花粉發(fā)芽率和花粉完整性的影響。高滲透壓緩沖液降低了發(fā)芽率和花粉破裂的風(fēng)險(xiǎn)(比例尺 = 100 μm)。


本次研究結(jié)果表明,體外萌發(fā)法和IFC活力法均適用于分析冷凍保存的番茄和辣椒花粉的活性,且二者間具有高度的線性相關(guān)性。但值得注意的是,體外萌發(fā)法需要測(cè)試者嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試方案,這包括緩沖液配方、測(cè)定溫度和萌發(fā)時(shí)間,并明確不同花粉形態(tài)和發(fā)芽水平分類標(biāo)準(zhǔn),相較而言,其更適用于特定研究地點(diǎn)的短期實(shí)驗(yàn);而IFC活力法是一種可在任意地點(diǎn)由任何用戶進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作的高通量檢測(cè)方法,更適用于涉及操作人員和實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)多、需要在更大時(shí)間窗口進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比的測(cè)試項(xiàng)目中。

—— 參考文獻(xiàn) ——

Langedijk, N.S.M., Kaufmann, S., Vos, E. et alEvaluation of methods to assess the quality of cryopreserved Solanaceae pollen[J]. Sci Rep 13, 7344 (2023). 

P2023080101.jpg

新一代花粉活力分析儀Ampha Z40

Z4023080101.jpg


全自動(dòng)花粉活力分析儀Ampha P20


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