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優(yōu)化光合效率是開發(fā)更可持續(xù)和高產作物品種的一個非常有前途的策略。這一方法有可能顯著提高田間作物的農藝性狀，已有幾項突破性成果證明了這一點，例如構建新的光呼吸支路、提高替代電子傳遞途徑的效率或增加熱耗散NPQ。6月7日，Science Advances在線發(fā)表美國加州大學伯克利分校植物與微生物生物學系Krishna K. Niyogi課題組題為"Multiplexed CRISPR-Cas9 mutagenesis of rice PSBS1noncoding sequences for transgene-free overexpression"的最新研究論文。報道了該研究小組通過CRISPR/Cas9工具編輯植物中自然存在的參與光保護過程的基因來改變光合作用。

研究人員通過對水稻PSBS1基因上游的非編碼序列進行了多重CRISPR-Cas9誘變，借助利用高通量篩選方法分離出了120個基因編輯的等位基因，基因敲除到過表達使得它們在體內具有不同的非光化學淬滅(NPQ)能力。過表達使OsPsbS1蛋白豐度增加了兩到三倍，與轉基因獲得的倍數變化相當。PsbS 蛋白豐度的提高增強了NPQ 能力和水分利用效率。在本研究解決的遺傳變異中，研究人員發(fā)現了5′UTR 插入缺失和倒位在分別驅動基因敲除/敲低和過表達表型中的作用。復雜的結構變異，如這里產生的252 kb的重復/倒位，證明了CRISPR-Cas9在促進基因組重大變化方面的潛力，而對轉錄組的脫靶擾動可以忽略不計。相關的研究結果可為未來針對超常等位基因的基因編輯策略提供參考，并推動了對具有加速光保護弛豫的基因編輯非轉基因水稻植物的研究。

本研究中，高通量篩選編輯等位基因的大致流程如下，通過農桿菌介導的轉化方法將針對PSBS1基因上游特定gRNA位點的CRISPR-Cas9構建體引入水稻愈傷組織，生成了覆蓋PSBS1表達水平范圍（從敲除（KO）到過表達（OX））的突變等位基因庫。使用高通量葉綠素熒光篩選評估不同等位基因的NPQ能力，從78株二倍體T0植株中鑒定出穩(wěn)定、可遺傳的表型。其中葉綠素熒光的測量通過葉綠素熒光成像系統(tǒng)MAXI-IMAING-PAM完成。

另外，植物表型與蛋白表達關系的研究結果是鑒定出兩種顯著提高PsbS蛋白豐度和NPQ的等位基因，但OX等位基因的頻率較低（1.67%）。研究發(fā)現，OX等位基因使OsPsbS1蛋白豐度增加了兩到三倍，增強了NPQ能力和iWUE。PsbS豐度和NPQ之間存在對數關系，表明PsbS豐度的微小增加對NPQ能力的影響很小，這導致在篩選過程中KO/KD突變的富集。

結構變異和表型效應的研究發(fā)現，5′UTR插入/缺失和倒位在推動KO/KD和OX表型中起著重要作用。復雜的結構變異（如252-kb的重復/倒位）顯著影響基因表達，而不會引起主要的脫靶轉錄組擾動。轉錄組分析顯示，在重復/倒位區(qū)域內外的差異表達基因，表明基因調控的目標性和特異性。

氣體交換和紅光依賴的表型研究發(fā)現，PSBS1的過表達在非常高的光強下增加了NPQ能力，但也顯示了在中等光強下PsbS蛋白豐度和iWUE之間的強相關性。這表明除了NPQ之外，其他因素（如類囊體醌的氧化還原狀態(tài)）可能參與了在不同光照條件下調節(jié)光合作用和氣孔導度。

總之，本研究的諸多發(fā)現強調了CRISPR-Cas9在通過靶向基因編輯產生顯著遺傳變異和改善農藝性狀方面的潛力。高通量篩選方法有效地鑒定出理想表型，但OX等位基因的低頻率表明隨機順式調控元件誘變的挑戰(zhàn)。理解順式調控機制并改進基因編輯策略，有助于開發(fā)具有顯著農藝效益的小效應等位基因。